Nature Technology

Tuesday, December 6, 2011

Kloonimine ja katseklaasi viljastamine

Enne praktilise tööga alustamist rääkis Mario Plaas meile kõigepealt kloonimisest. Kloonimisega üritatakse luua täpselt identne järglane, kelle DNA koodi on tavaliselt muudetud, et saada paremaid omadusi. Kloonitakse tavaliselt rotte ja hiiri, sest nende DNA-d on lihtne muuta ja nende tiinus on väga lühike, mis aitab tulemusi ja probleeme kiiresti märgata. Kloonimisega üritatakse luua idealiseeritumaid liike (nt. lehm kes annaks rohkem või rasvasemat piima). Lisaks sellele saab kloonimise abil uurida haiguste iseloomu ja katsetada erinevaid ravimeid. Näiteks aretatakse hiir kes nakatub kergelt tuberkuloosi ja siis saab tema peal ravimeid katsetada jne.

Järgnes katseklaasi viljastamise praktika. Selle jaoks jagati õpilased kahte rühma ja mõlemad rühmad said ühe ülesande: sperma ettevalmistamine või munarakkude ettevalmistamine. Ise tegelesin munarakkude ettevalmistamisega. Munasarjast imesime nõelaga kõigepealt munarakke sisaldavaid folliikuleid, mille leidis üles tumedate laikude abil. Kui tuubid olid vedelikku täis võtsime pipetiga pealmise osa ära ja alles jäi 1cm vedelikku. Vedelikule lisasime 3ml munarakkude pesulahust. Seejärel panime vedeliku mikroskoobi alla et kõike selgelt näha ja korjasime pipetiga kõik munarakud kokku ja asetasime need teisele alusele ,et need hiljem viljastada.

Kui spermapoisid sperma ettevalmistamisega lõpetasid, lisasime need munarakkude lähedale ja katseklaasi viljastamine oli edukalt lõppenud. Sellega lõppeski kolmas praktika tund. Rohkem infot rakkude ja kloonimise kohta siit.

Esimene kloonitud loom oli lammas

http://www.metrolic.com/wp-content/uploads/2010/07/dolly-fig-13-13.jpg

Kunstlik viljastamine

http://www.femme.ee/img/artiklisse2/lastetu1.jpg

Näide konnade kloonimisest

http://static.howstuffworks.com/gif/cloning-frog.gif

DNA konsentratsioon ja poolkoksimäed

Teise praktikapäeva alguses räägiti meile poolkoksimägedest ja näidati selle kohta slaide. Poolkoks on musta värvi aluseline aine mille ph tase on 12-13. Poolkoksi tekib palju näiteks põlevkivi kaevandustes, kuhu nad kokku mäeks kuhjatakse koos muude jääkainetega. Otseselt poolkoks nii kahjulik polegi, aga kui vihma sajab, eralduvad mürgised ained ja need on maapinnale ja keskkonnale üldiselt väga kahjulik, eriti suur probleem on see Eestis ja kahjuks pole veel effektiivset lahendust leitud. Meile räägiti veel ühest katsest kus prooviti leida selline muru liik, mis puhastaks pinnast toksilisest ainest, kuid selle teostamine oleks liiga kalliks läinud. Rohkem infot poolkoksi kohta leiad siit.
Jätkasime ka DNA teemaga. Nimelt mõõtsime oma esimesel päeval eraldatud DNA konsentratsiooni. Selleks kasutasime Nanodrop 1000 aparaati. Asetasime aparaadile 2 μl DNA lahust ja see peale mõõtmist andis meile tulemused. Peale konsentratsiooni saime ka puhtuse taseme. See lõpetas meie DNA eraldamise praktikumi.
Muidugi saime ka eelmisel praktikal õhukülvi karpi kasvama pandud baktereid näha. Ühe nädalaga olid bakterid silmale nähtavateks üpris suurteks kolooniateks kasvanud. See lõpetas meie DNA eraldamise praktikumi.

Poolkoksimägi

http://www.kbfi.ee/Envir/Assets/images/valitoo/lysimeetria5.JPG

http://www.kbfi.ee/Envir/Assets/images/valitoo/lysimeetria4.JPG

Poolkoksi uurimine

http://www.kbfi.ee/Envir/Assets/images/valitoo/magi91.JPG

Monday, December 5, 2011

Genoomse DNA eraldamine süljest

Kõigepealt rääkis Kaarel Krjutškov DNAst üldiselt ja selle eraldamisest. Lisaks tutvustas ta laua peal olevaid vahendeid mis olid DNA eraldamiseks vajalikud (pipetid,vortex ja erinevad ained). Kõigile jagati tööjuhendid, aga enne tööle asumist harjutasime pipettidega vee tõstmist, et hiljem kõik probleemideta läheks. Oli kolm erinevat pipetti, erineva koguse aine tõstmiseks (1000-100 μl, 100-10 μl ja 20-2 μl).
Töö esimene samm oli oma sülje kogumine tuubi. Seda tuli koguda umbes 1,5 ml. Seejärel tuli 500μl sülge uude tuubi panna ja lisada tuli lisada lüüsipuhvrit, proteinaas K-d ja 10% SDS-i. See protsess aitas lõhkuda raku väliskihi, jättes DNA puutumata. Pärast seda tuli tuub oma nimega märgistada ja inkubeerida 30 minutiks 53 kraadi juures, vahepeal segades. 30 minuti möödudes tuli tuubid panna jäässe viieks minutiks jahtuma. Nüüd oli lahuses näha juba sademeid. Nüüd tuli tuubi tsentrifuugida, et tekkinud sade lahusest eraldada. Selgelt oli näha tekkinud sadet tuubi põhjas, mis sisaldas valkusid ja rakumembraani, DNA oli vesilahuses. Tuli võtta uus tuub ja pipeteerida sinna vesilahus ILMA sadet puudutamata (700 μl). Sademega tuubi polnud enam vaja. Siis lisasime vesilahusesse 700 μl isopropanooli ja segasime lahust. Nüüd võis silmale nähtavat DNA sadet näha. Järgnevalt inkubeerisime toatemperatuuril 5 minutit ja tsentrifuugisime samuti 5 minutit. Tuubi küljele tekkis sade (DNA) ja nüüd oli vaja vesilahus eemaldada ilma sadet puudutamata. Seejärel lisasime 300 μl 70% etanooli ja tsentrifuugisime jälle
(2 minutit). Pärast seda tuli võimalikult palju eranooli eemaldada ja jällegi ilma sadet puudutamata. Tuli uuesti inkubeerida, seekord 37 kraadi juures ja avatud kaanega. Inkubeerima pidi niikaua kuni etanooli lõhna enam ei tundnud. Lõpetuseks lahustasime sademe 50 μl destilleeritud vees ja tegime vortexi. Tuli veenduda, et sade lahustus üles. Olime edukalt DNA süljest eraldanud.
Tunni lõpus lasi Kaarel meil õhukülvi karpidega baktereid koguda ja need kasvama panna. Õhukülvi karbis on väga palju toitaineid, mis aitavad bakteritel väga kiiresti kasvada. Seega kaasneb ka oht et sinna mõni ohtlik bakter satub. See lõpetas meie esimese tunni. Klikkige siia, et rohkem DNA kohta teada saada.